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新手入门:质粒的转化,满满干货

  • 发布日期:2020-09-10      浏览次数:65
    • 原理:在受体细胞经过化学试剂或者电击处理等方法处理后,受体细胞的膜通透性发生改变,质粒DNA或者以其为载体的重组DNA分子,进入到细菌体内而实现扩增。

      感受态细胞:是指细胞自然或者经过诱导处于容易吸收外源DNA的一种生理状态。在基因工程中,用于转化的受体菌(Restriction-Modification 缺陷变异株,以防止对导入外源DNA进行切割)一般通过诱导的方式实现。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大,直观的说,使得细胞膜表面出现一些孔洞,便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性,这种孔洞会被细胞自身所修复。

       

      质粒的转化主要包含:

      Ⅰ感受态细胞制备

      Ⅱ质粒DNA转化

      Ⅲ质粒DNA的提取

      (Ⅰ)感受态细胞制备

      1)从新活化的大肠杆菌(常用DH5a)平板上挑取一个单菌落,接种于3ml LB培养基的试管中,37℃振荡培养过夜。

      2)将该菌悬液按照1:100转接到液体培养基中,100ml,37℃振荡扩大培养,2~3h。当培养液开始浑浊时,间段性测试OD600,在数值为0.3-0.5时停止培养。

      3)培养好的菌液转移到离心管中,冰上放置20min,0℃-4℃离心10min(4000r/min)。

      4)弃掉上清,管口倒置以便培养液弃除干净。

      5)加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30ml,小心悬浮沉淀细胞,冰浴30min。(氯化钙的浓度和纯度非常重要,不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率)

      6)4℃离心10min(4000r/min)。

      7)弃掉上清,用0.1mol/L氯化钙2ml冰浴悬浮细胞(冰上放置)片刻,感受态细胞制成。

      8)可直接用于实验,4℃保存。也可分装长期保存,加入总体积15%的灭菌甘油,-70℃条件下保存。

      (Ⅱ)质粒DNA的转化

      1)取100ul新鲜制备的感受态细胞,加入质粒1ul DNA混匀,同时设置对照组(未加质粒,未加受体菌,已知具有转化活性的DNA)。

      冷冻的感受态细胞要在冰上解冻,待管中最后一点冰融化后,迅即加入DNA. 解冻感受态细胞温度高于0℃,会降低转化效率。

      2)冰浴30min,离心管放到42℃保温90s(不要摇动离心管)。冰浴时间短于30min ,可能影响转化率。然后迅速冰浴2min。

      3)向离心管加800ulLB液体培养基,37℃振荡培养1h(150r/min)。37℃生长1小时能够对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有最-佳效果。

      4)取适当(50ul)的复苏细胞培养液,涂布在含抗性的选择性培养基上,将培养皿放置在37℃恒温培养箱中,正置30min。等菌液完全被培养基吸收后,倒置培养皿,在37℃恒温培养箱中,培养12~16h,出现菌落。

      5)菌落结果:

      ① 无菌落

      失败或者培养条件不充分

      ② 布满菌落,

      呈苔样,失败。可能是抗生素浓度不够或失败。出现大菌斑,大多是由于霉菌污染所致

      ③ 布满菌落

      浓度太高,失败

      ④ 出现菌落

      符合要求

      Ⅲ)质粒DNA的提取

      质粒DNA的提取,由于其本身分子量小,一般采用碱裂解法提取。目前已研发出多种质粒提取试剂盒,实验操作简单,只需按照产品操作说明操作即可。不过对于其中主要试剂和作用的理解,能够避免实验过程中的一些问题,或者能够geng好的解决问题。

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