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质粒转化步骤 @昆山远慕

  • 发布日期:2020-09-14      浏览次数:124
    • 一.实验原理

      质粒可携带一种或多种抗生素抗性基因,其赋予携带它们的细菌对特定抗生素的抗性。研究人员可以通过人工选择(即在抗生素存在下培养细菌),轻松地将含有该质粒的细菌与不含有该细菌的细菌分离。

      Luria肉汤(LB)是一种富含营养的培养基,通常用于培养实验室中的细菌。向LB中添加琼脂导致形成细菌可以生长的凝胶,因为它们不能消化琼脂但可以从LB内收集营养。向该凝胶中添加抗生素只允许选择那些对该抗生素具有抗性的细菌 - 通常由携带抗生素抗性基因的质粒赋予。

      LB琼脂平板经常用于分离携带特定质粒的细菌的个体菌落。然而,液体培养物能够支持更高密度的细菌,并用于培养足够数量的细菌以分离足够的质粒DNA用于实验用途。

      二.试剂及实验器材准备

      1.液体培养基配制:

      胰蛋白胨Tryptone:10g

      酵母粉Yeast:5g

      NaCl:10g

      dH2O定容至1000ml

      2.LB平板配制:

      胰蛋白胨Tryptone:10g

      酵母粉Yeast:5g

      NaCl:10g

      琼脂糖:12g(工作浓度6-25g/L)

      dH2O定容至1000ml

      3.无菌平板(不可高压):通常使用60 mm x 15 mm平板,200ml琼脂浇筑4-5个平板(若琼脂太少过夜孵育后容易干裂),可在其上单独区分最多约100个菌落

      4. Falcon细胞流式管(不可高压)5.可高压灭菌的烧瓶:(用1L瓶制备400ml琼脂,在500ml瓶中制备200ml琼脂,需要额外的空间防止沸腾。)

      6.抗生素:1000倍的储备溶液(氨苄青霉素钠,库存浓度100mg/ml,溶解后,0.22um过滤除菌,分装,-20℃保存数月。加入培养基时一定要等灭菌后的培养基冷却到40-50时再加入。含氨苄青霉素的培养基平板在4℃可保存2周。)

       

      三.实验步骤

      1.溶解质粒: 将含目的基因质粒的 纸剪下(比画得圈稍大),并剪成碎片,放入无菌EP管,加20到50ul无菌水或TEbuffer, 可用枪头将滤纸捣碎,室温过夜(或为了促溶,还可60℃水浴)。后漩涡振荡5min,离心,取上清即为质粒用于后续转化。

      2.LB液体培养基、LB平板粉末 搅拌溶解后,121℃高压灭菌半小时,高压灭菌过程中高压釜胶带会变暗。液体LB 无菌环境下冷却至室温,放置4℃冰箱备用;LB平板 熔融凝胶混合物在凝固前转入40-50℃(视抗生素加入培养基温度而定)水浴锅,至少5分钟,备用。

      3.准备培养皿、Falcon细胞流式管,紫外线消毒30min;(在培养皿上标记日期、抗生素特性。)

      4.准备抗生素(要制备终浓度为100 ug/mL氨苄青霉素钠的平板,则应制备100,000 ug / mL(100 mg / mL)的储备溶液。测量100毫克氨苄青霉素钠粉末,将其加入1毫升水中,通过涡旋溶解,并过滤灭菌。)

      5.添加抗生素至LB液体培养基、LB平板熔融凝胶混合物中(温度不宜过高,40-50℃(视抗生素分解温度而定,氨苄青霉素钠加入温度为40-50℃),防止抗生素分解)

      6.浇筑LB平板:浇注后将盘子旋转以除去气泡,确保琼脂在板底部均匀分布,凝固后倒置。200ml琼脂浇筑4-5个平板(若琼脂太少——板过薄,过夜孵育后容易干裂)若浇筑过程瓶中的琼脂凝固,可再次通过高压灭菌器或微波炉将琼脂重新液化(用微波炉时防止沸腾!)室温下固化大约需要30min,在室温下过夜使之干燥。在过夜干燥后,将板在4℃下(用PE手套包好)储存直至使用。

      7.取感受态细胞置于冰浴中,如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷(提前冰上预冷1.5mlEp管)的离心管中,置于冰浴中。

      注意:一次转化感受态细胞的建议用量为50-100ul,可以根据实际情况分装。所用DNA体积不超过感受态细胞悬液体积的1/10。(根据加入质粒体积提前准备无菌10ul无滤芯枪头)

      8. 向感受态细胞悬液中加入目的DNA/ pUC19质粒(对照:证实感受态细胞是否有问题)(100ul的感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和),轻弹混匀,在冰浴中静置30min。

      9. 将离心管置于42℃水浴中放置60-90s,然后快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却2-3min,该过程不要摇动离心管。

      注意:此步骤也可将离心管置于室温进行,夏季或室温较高时,可放置5-8min, 如果室温较低,可延长时间至8-15min。条件允许建议使用42℃热激方法。

      10. 向每个离心管中加入900ul无菌的LB培养基 (不含抗生素),混匀后置于37℃摇床振荡培养45 min (将1.5mlEp管水平放置,充分摇混匀),目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。

      11. 将离心管内容物混匀,吸取100ul (第一次涂板,可设置不同的梯度:20ul、50ul、70ul、100ul)已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体培养基上,用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收(15-20min),倒置平板,37℃培养12-16h(过夜)。

      注意:涂布用量可根据具体实验来调整。如转化的DNA总量较多,可取更少量转化产物涂布平板;反之,如转化的DNA总量较少,可取200-300ul转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少,可通过离心(4000rpm, 2min)后吸除部分培养液,悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。涂布剩余的菌液可置于4℃保存如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板。)

      12. 使用无菌枪头或牙签,从LB琼脂平板上选择一个菌落。

      13. 将枪头或牙签放入液体LB +抗生素中并旋转。

      14. 将细菌培养物在37℃下在振荡培养箱中 180rpm孵育12-18h。

      15. 孵育后,检查生长,其特征在于培养基中的混浊雾度。

      注意:良好的阴性对照是LB培养基+抗生素,没有任何细菌接种。过夜孵化后,您应该看到这种培养物没有生长。

      对于细菌的长期储存,选择甘油

      1、配制30%(体积分数)的甘油水溶液,离心管若干灭菌备用.

      2 、将细菌用富集培养基摇瓶培养过夜,根据保藏要求(有些要求高的项目中菌要达到一定OD值)培养.

      3 、将菌液和灭菌的甘油水溶液按照2:1的体积比例在离心管中混匀(使最终甘油浓度为10%,其实甘油多点也没关系),-70°冰箱保存.

      16. 用小提试剂盒从大肠杆菌培养物中分离质粒DNA。

      17. 样品进行电泳检测:1%琼脂糖凝胶电泳,上样量为2ul,紫外灯下观察,最明亮的带为超螺旋形式,可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。

      18. 质粒纯化

      1) 将之前提取好的质粒放入1.5ml离心管中,加入1/10体积的3mol/L无菌乙酸钠溶液。

      2) 加入2倍体积的无水乙醇,放置于-20℃沉淀4-6h或过夜。

      3) 4℃,高速离心机14000rpm,离心20min.

      4) 弃去上清,70%乙醇洗2次。

      5) 空气干燥,可置超净工作台干燥。

      6) 加200ul无菌水溶液干燥后所得沉淀,即为质粒溶液。

      7) 紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。

      四.提示和常见问题

      (1)高拷贝质粒和低拷贝质粒有什么区别?

      拷贝数是指单个细菌细胞内单个质粒的拷贝数。大质粒通常具有低拷贝数(每个细胞大约一个或两个拷贝)并且它们需要生长更长的时间段(大约18-30小时)。另一方面,较小的质粒可以大量存在,每个细胞50个或更多,并且具有高拷贝数。高拷贝数质粒应该仅需要平均生长12-16小时。无论质粒大小如何,质粒的某些特征可使其低拷贝。请参阅质粒的信息页面以确定您的质粒是高拷贝还是低拷贝。

      (2)过夜孵化后,我没有任何增长。什么地方出了错?

      尝试将文化培养更多时间。一些细菌培养物生长得更慢。此外,在30°C而不是37°C温育的细菌通常需要更长的孵育时间。

      仔细检查LB培养基中的抗生素是否与质粒上的抗生素抗性相匹配。

      如果LB琼脂平板上的细菌不是新鲜的,你应该将细菌划到新的LB琼脂平板上,然后在液体培养基中生长。

      更多的曝气可能有助于增加培养物的密度。通常培养物在150-250rpm下摇动,将其增加至350-400rpm以获得更高的细胞密度。

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