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凝胶迁移实验(EMSA)实验了解下!

  • 发布日期:2020-11-05      浏览次数:91
    • 凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验(EMSA,electrophoretic mobility shift assay),是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验,也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。

      一、实验原理

      EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针,当核酸探针与样本蛋白混合孵育时,样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物;这种复合物由于分子量大,在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢,而没有结合蛋白的探针则较快;孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后,蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带,说明有蛋白与目标探针发送互作。

      二、实验操作步骤

      1、实验前准备

      (1)合理的实验方案

      根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组,如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等

      (2)样本制备

      可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量,实验中等量加入蛋白。

      (3)探针制备

      根据实验要求设计不同的探针并添加标记,可以合成核酸后自行添加,部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记,生物素使用相对较多。

      2、形成蛋白-探针复合物

      (1)在0.5ml离心管中按顺序将下列组份混匀:

      蛋白样本(2-5μg)Xμl
      poly d(I-C)1μl
      Binding Buffer2μl
      Nuclease-Free ddH2OXμl
      总体积9μl

      (2)冰浴5min后,加入1μ探针。(对照组加1ul对照探针)

      (3)PCR仪中室温(20-23℃)温育30min。

      3、制备凝胶,电泳

      (1)制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶:(注意根据试剂情况按比例调整总体积)

      5XTBE1ml
      30%Acrylamide/Bis2.2ml
      deionized,sterilewater6.62ml
      80%Glycerol80μl
      10%AP90μl
      TEMED10μl
      总体积10ml

      (2)按标准步骤制备凝胶。

      (3)加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min,与电泳完毕后冲洗加样孔。

      (4)混合样本及电泳缓冲液,点样电泳。


      (5)将电泳槽置于冰上或者4℃环境中,恒压100V进行电泳,直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。(大约50-60min,根据实际情况调整电泳时间及电压;电泳时间不宜过长)

      4、转膜

      (1)在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶,膜,滤纸和纤维垫。

      (2)按如下顺序组装“三明治”:纤维垫,滤纸,凝胶,膜,滤纸,纤维垫。注意电极,确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。

      (3)在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中,恒压60V转膜1h。(注意根据实际情况调整电压及时间)。

      5、检测

      (1)去除转好的膜,放入合适的盛有缓冲液的容器中,冲洗。(注意整个检测过程避免膜干燥

      (2)去掉冲洗缓冲液,加入封闭液后轻微震荡,室温封闭20min。

      (3)加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP conjugate),室温震荡孵育45min。(勿将酶标记物直接加到膜上)

      (4)去掉酶联物稀释液,用洗涤缓冲液洗膜三次,每次室温轻微震荡1 0min。

      (5)配置反应底物,均匀加至膜上,室温孵育5min。(可以在加完底物后,用薄膜轻轻覆盖在膜上,是底物均匀覆盖,注意不要产生气泡)

      (6)化学发光成像系统曝光成像(曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整)。


      常见问题

      1、为什么看不到迁移带?

      1)蛋白样本提取质量不高,蛋白降解或者提取量不足。

      2)样本中没有可以与探针结合的蛋白。

      3)探针与蛋白无特异性的相互作用。

      4)转膜效率低,蛋白或者探针未转移到膜上。

      5)曝光或者成像时间过短。

      在Super-Shift EMSA测定中看不到Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因:

      6)抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA,只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。

      7)测定的活化的DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到Super-Shift的带,也看不到DNA/蛋白复合物的量的减少

      8)使用的抗体过度稀释。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。

      9)多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下,虽然看不到Super-Shift的带,但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。

      2、为什么实验背景高?

      1)曝光或者成像时间过长。

      2)封闭时间不足或者效率不高。

      3)洗涤效果不佳。

      4)实验过程中膜没有一直处于湿润状态。


      3、EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探针?

      对每一个特定的结合蛋白和探针,所用的纯化蛋白,部分纯化蛋白,粗制核抽提液需作优化:一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间,可将蛋白:DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍;用粗制核抽提液,需要2-10ug蛋白形成特异的复合物。

      部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80℃、探针应保存在-20℃以防止降解。

      无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。

      4、Poly(dI:dC),非特异性竞争DNA,特异性竞争DNA在EMSA测定中的作用?

      Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶组成。在EMSA反应中加入poly(dI:dC),可抑制粗制核抽提液中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式实验前进行优化,一般用量大约在0.05mg/ml左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时,不必一定加入poly(dI:dC),如加入,则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液,每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。

      为确定所形成的复合物的特异性,在含或不含增量的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时,作结合反应的竞争实验。一般,特异竞争探针是非标记的DNA,其序列与标记探针相同,故能与标记探针竞争与结合蛋白的反应。非特异竞争探针的长度组成和DNA探针相同,但序列不同。如果结合蛋白与标记探针的结合被特异竞争探针抑制,而不受非特异探针的影响表明靶结合蛋白的存在。特异与非特异性竞争DNA的用量也需优化或滴定,但竞争DNA通常是标记的探针用量的30-100倍(w/w)。

      5、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开?

      将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合,蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%,在特定条件下可用高或低的浓度。也可将TGE缓冲液(12.5mM Tris,pH8.3,95mM 甘氨酸,0.5mM EDTA)用于不稳定的蛋白/DNA复合物。在4℃进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。

      当带型不紧密出现拖尾时,表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合,以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量,或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物,但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染,应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。

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