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支原体检测系列的常见答疑

  • 发布日期:2020-11-27      浏览次数:171
    • 问:在用qEP做支原体检测的时候,加入内控对照品,在仪器设置上是需要选择两个通道吗?

      答:是需要2个通道,一个FAM, 一个HEX,HEX是对应内控的通道。

      问:我想问一下,7500仪器里面没有HEX这个通道选项,可以用哪个通道代替呢?

      答:7500这款是没有HEX荧光标识,不过问过厂家,说7500有VIC,可以用VIC通道。

      问:qPCR结果判定中,FAM positive,HEX irrelevant中这个不相关是具体指什么?

      答:这个不相关是指如果FAM是阳性,那么由于扩增时存在竞争性抑制,所以内控是否有扩增,其无关紧要。

      问:在用样品制备试剂盒时,进行支原体DNA提取时,加入内控对照品,实际上是监控在提取操作总是否能够binding支原体DNA,而无法监测这步操作的回收率的,是吗?

      答:“实际上是监控在提取操作总是否能够binding支原体DNA”,可以这么理解,或者说是在监测整个提取过程。我们又问了一下厂家,内控和样品的提取效率是一样的,这样可以反映样品的真实-情况,因为只要内控提取后能测出来,那就表明提取是没有问题的。极少量的支原体如10CFU的,通过提取,也是可以检测到的,表明灵敏度是没有问题的。样本Ct值和10CFU的Ct值比较,是可以进行相对定量的。

      问:你们好,我问一下你们这个Venor Gem qEP试剂盒能做放行检测吗?

      答:放行应相当于国外说的release testing, 这个qEP试剂盒是符合国外药典规定的性能,能做放行检测的。同时需注意要做支原体DNA抽提才行,抽提是用另外一个盒子,见厂家的venor gem sample preparation kit。

      问:这个如果是用来检测细胞上清,是不是就不用提取DNA了呢?

      答:只要是跟药典有关,跟临床治疗或制药检验有关,就需要提取DNA。如果仅仅是科研用培养细胞,筛查支原体,则可以不提。

      问:询问qPCR仪器的设置

      答:具体可见MB厂家文件Venor?GeM qEP: Cyclers Programming,可从网-站上下载。

      问:被动参比染料是选“none”吧?

      答:对,没有ROX,选none

      问:大家好,想咨询一下,咱们支原体DNA提取时所取的样本量是依据什么定的呢,比如,我们有CAR-T细胞,病毒液等,如果CAR-T细胞按细胞数来的话取多少细胞数比较好,或者如果病毒液按体积的话多少体积更佳呢?

      答:支原体 DNA 提取试剂盒可从多含有 1X 106细胞/ml 的细胞上清中直接分离 DNA,病毒没有要求。总体积多 200μl。提取的样本就是细胞上清,ATMPs(高级医用药品),细胞培养基等。病毒液应该也是初来自细胞上清吧。样本量是根据支原体污染量得出的经验值,跟核酸纯化柱上的DNA膜吸附能力有关。

      问:病毒液就是类似细胞上清的。如果体积大于200ul的话我们可以浓缩,但是这个体积有没有一个上限呢?

      答:体积有上限,是200 to 1000 ?l, 可以参看经典法试剂盒的那个说明书里对样本处理那一块。这个样本量同时还考虑了灵敏度,使检测达到-佳的灵敏度。如果细胞数高于1X 106细胞/ml ,那必须要先调细胞数了。或者减少样本体积,总细胞数不超,也行。

      问:您好,我这边要提取10cfu对照品的基因组,10cfu对照品的说明书写着用1ml基质重悬,基因提取试剂盒说一次上样200μl进行提取,想问您一下,用200μl基质重悬10cfu可以吗,想一次提完。

      答:还是建议用1ml的基质重悬,因为灵敏度是以10CFU/ml为单位的。如果用200ul,浓度就高了。厂家建议10CFU标准品复溶了以后,要立即用完,不要再保存,担心可能降解。

      问:那1ml溶解的标准品,按提取试剂盒的要求,就得用多个管子一次提完对吧?

      答:是的。

      问:这个抽提试剂盒的收率有多少,是磁珠还是吸附柱?吸附柱的收率-好能有,因为以前我们用其他品牌的抽提试剂盒,收率只有百分之六,这样的话,就存在假阴性结果的可能。

      答:是吸附柱的方法。提取试剂盒的COA里,用的是很少量的支原体10CFU/ml,提取DNA后都可以检测到。厂家来信说,产率依赖于DNA的类型(如GC含量,是基因组还是质粒)、操作者的技巧以及样本基质的情况。因为这些情况,操作者很难达到生产商所给的比率,从而形成各种讨论,因此产率没写到说明书里。

      问:要检测支原体的培养基中有酚红,是否还需要抽提?

      答:只要是在25ulPCR体系中加入的样本量≤2ul,酚红就不会对qPCR构成问题。更高浓度的酚红会引起基线偏移,造成灵敏度降低。如果仅仅是筛查,则不需要抽提DNA。如果是做10CFU/ml的产品放行检查,则需要抽提了。细胞基质的验证总是要做的。

      问:做qPCR,一个阴性对照Ct约为40,也有扩增曲线。是什么原因?

      答:Ct值大于40可能是由于产生非特异性信号(如primer artefacts)以及极微小的污染所致。 但是,该结果是不具有可重复性的,因此结果仍然是阴性。

      问:一步法的盒子的灵敏度是否总低于经典法试剂盒?有没有可能一步法的盒子也能检测10CFU?

      答:厂家回复如下:意思是一步法的样本量为2ul用于支原体筛查,经典法为10ul,用于产品的放行检测。检测10CFU的标准品非常具有挑战性。一步法因为样本量不够,很难达到10CFU/ml。如果客户想要包含DNA聚合酶的PCR试剂盒,可以选择VenorGeM Classic G型试剂盒。它和经典法(不含酶)的交叉验证确实做过,显示同样的灵敏度。但全套的验证没有做过。

      问:支原体10cfu标准品是干粉吧? 配完后是多少体积?

      答:是冻干粉,加基质液后是1ML体积。

      问:基质液产品里带吗?

      答:这个产品里不带,是客户自己要检测哪类样品,就用样品里的基质液(例如用的哪个培养基)

      问:PCR经典法,跑胶时体现1条阳性带,是否代表PCR经典法可以检测多种支原体,无法区分支原体种类。

      答:PCR经典法,跑胶时为1条阳性带,无法区分支原体种类,需要将扩增产物测序鉴定。

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