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琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量

  • 发布日期:2020-12-03      浏览次数:110
    • 一.原理

      带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。其中,凝胶电泳 由于其操作简便、快速、灵敏等优点,使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首-选标准方法。与蛋白质分子类似,核酸分子也是两性解离分子。在pH3.5时,碱基上的氨基基团解离,而三个磷酸基团中只有第一个磷酸解离,整个分子带正电荷,在电场中向负极泳动;在pH值为8.0-8.3时,碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电荷,向正极移动。不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同,在自由泳动时,各核酸分子的迁移率区别很小,难以分开。所以采用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物,发挥分子筛的功能,使不同分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异,达到分离的目的。

       

      1)影响泳动的四大因素:

      ① 影响泳动的首要因素是电泳样品的物理性质:包括电荷多少、分子 大小、颗粒形状和空间结构。一般来说颗粒带电荷的密度愈大,泳动速率愈快;颗粒物理形状愈大,与支持物的摩擦力越大,泳动速率越小。即泳动率与颗粒的分子大小、介质粘度成反比;与颗粒所带电荷成正比。

      ② 支持物介质:DNA的凝胶电泳常使用两种支持材料:琼脂 糖和聚丙烯酰胺凝胶。通过这两种介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小,分离不同分子量的核酸片断。琼脂糖的孔径大,可以分离长度为100bp至60kb的核酸片断;聚丙烯酰胺凝胶的孔径小,可分离小片断(5-50bp)的核酸。

      ③ 电场强度:电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度或电压梯度。电场强度愈大,带电颗粒的泳动率愈快,但凝胶的有效分离范围随电压的增大而减小。在低电压时,线性DNA分子的泳动率与电压成正比。一般凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm。

      ④ 缓冲液离子强度:缓冲液是电泳场中的导体,它的种类、pH值、离子浓度直接影响电泳的效率。Tris·Cl缓冲体系中,由于Cl-的泳动速度比样品分子快得多,易引起带型不均一现象,所以常用TAE、TBE、TPE三种缓冲体系。缓冲液的pH值直接影响DNA解离程度和电荷密度,缓冲液pH值与核酸样品的等电点相距越远,样品所携带电荷量越多,泳动速度越快。核酸电泳缓冲液,常采用偏碱性或中性条件,使核酸分子带负电荷,向正极泳动。缓冲液的离子强度与样品泳动速度呈反比,电泳的适离子强度一般在0.02-0.2之间。

      2)指示剂

      电泳过程中,常使用一种由颜色的标记物以指示样品的迁移过程。核酸电泳常用的指示剂有两种:溴酚兰——成蓝紫色;二甲苯青——成蓝色。溴酚兰的分子量为670Da,在不同浓度凝胶中,迁移速度基本相同,它的分子筛效应小,近似于自由电泳,故普遍用作指示剂。二甲苯青的分子量为554.6Da,携带的电荷量比溴酚兰少,在凝胶中迁移率比溴酚兰慢,常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳,也有溴酚兰和二甲苯青混合应用。指示剂一般加在上样缓冲液中,为了使样品能沉入胶孔,还要加入适量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。

      3)染色剂

      核酸经过染色才能显示带型,-常用的是溴化乙锭染色法。溴化乙锭(EB)是一种荧光染料,这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间,在紫外线激发下,发出红色荧光。激发荧光的能量来源于两个方面,一是核酸吸收波长为260nm的紫外线后能将能量传送给溴化乙锭,二是结合在DNA分子中的EB本身,主要吸收波长为300nm和360nm的紫外线的能量,来源于这两方面的能量,终激发EB发射出波长为590nm的可见光谱红橙区的红色荧光。EB-DNA复合物中的EB发出的荧光,比游离的凝胶中的EB本身发出的荧光强大10倍,因此不需要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型。通常,在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB,可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况,这种方法使用于一般性的核酸检测。

      由于EB见光易分解,故应存棕色瓶中于4℃条件下保存。单链DNA、RNA分子常存在自身配对的双链区,也可以嵌入EB分子,但嵌入量少,因而,荧光较低,其低检测量为0.1μg。

      二.材料与方法

      1 材料

      RNA样品

      2 仪器、用具

      电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、微波炉、移液器等

      3 试剂

      (1) 1×TAE 电泳缓冲液

      (2) 溴化乙锭溶液(EB)

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