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植物愈伤组织培养以及再分化

  • 发布日期:2020-12-07      浏览次数:116
    • 实验概要:了解培养基母液的配制方法和注意事项;掌握培养基的配制和灭菌方法,掌握植物组织培养的一般方法

      实验原理

      (一)植物细胞的全能性  植物细胞的全能性即是每个植物的本细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因,因此在一定培养条件下每个细胞都可发育成一个与母体一样的植株。这个概念虽然在本世纪初已经提出,但在当时的技术条件下,在实践上并没做到,经过几十年来组织培养技术的不断改进,目前细胞的全能性不但在理论上完全被证实,而且为组织培养在实践上的应用奠定了基础。 植物细胞要表现出全能性,须经过几个步骤: 成熟细胞→分生细胞→胚状体→完整植株。  成熟细胞→愈伤组织→出根出芽→完整植株。

        脱分化也就是已经分化定型的细胞,经过诱导成为重新恢复了分裂能力(也就是成为分生状态)细胞的过程。 不但植物体细胞可以表现全能性,花粉在培养条件下也可能进行脱分化,通过愈伤组织或胚状体发育成单倍体植株。 诱导细胞的脱分化,需要许多外界条件。任何一个分化的细胞都具有保持分生组织状态的潜势,不过它平常处于受抑制的状态,消除抑制作用就可以使细胞恢复分裂。在各种外界条件中,外源激素对脱分化起重要作用。有些植物的外植体仅需加入生长素(IAA"吲哚乙酸",NAA"萘乙酸",2,4-D)即可诱导细胞的分裂与生长,如菊苣;有的仅需加入加细胞激动素类,如大豆、萝卜;另一类需加生长素和细胞激动素类,如烟草髓、胡萝卜、马铃薯;还有一类不需加任何激素,如冠瘿组织,烟草肿瘤组织。

      (二)组织的分化与器官建成  外植体诱导出愈伤组织后,经过继代培养,可以在愈伤组织内部形成一类分生组织(meristemoid)即具有分生能较往年小细胞团,然后,再分化成不同的器官原基。有些情况下,外植体不经愈伤组织而直接诱导出芽、根。所以器官发生有两种方式,即直接和间接的。  (1)外植体→器官发生(根、芽或胚状体)→再生植株。 (2)外植体→愈伤组织→类分生组织→根、芽→再生植株。 根是组织培养中易形成的器官,形成芽的培养基条件常有不同,有时芽与根可以同时在组织培养中形成,一般说,培养物中形成的芽如胡萝卜悬浮培养,油菜愈伤组织等。在组织培养中通过根、芽诱导再生植株方式有三种:一种在芽产生之后,于芽形成的基部长根而形成小植株,一种是在根上生长出芽来,另一种即在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根,然后两者结合起来形成一株植物。

      (三)培养基的组成 培养基中各成分的比例及浓度与细胞或组织的生长或分化所需要的最-佳条件相近似成功地使用该培养基进行组织培养的主要条件。营养培养基一般由无机营养、碳源和能源、维生素、植物激素(生长调节剂)和包括有机氮、酸和复杂物质的添加剂组成。

      1、无机营养:矿质元素(矿物质)对植物的生命非常重要。例如:Ca是细胞壁的组成成分;氮是氨基酸、蛋白质、核酸和维生素的重要组成成分;镁是叶绿素的组成成分;铁、锌和钼是某些酶的组成成分。除了C、H、N、O外,还有12种其他元素是植物生长所必需的。植物对元素的需求浓度大于0.5mol/L时,这些元素称为大量元素;而需求浓度小于0.5mol/L的元素则成为微量元素。和一般植物对元素的需求一样,多种盐能满足组织培养对微量元素和大量元素的需求。N、K、P、Ca、S、Mg为大量元素。必需的微量元素有Fe、Mn、B、Cu、Zn、I、Mo、Co,植物对这些元素的需求量为微摩尔每升数量级。为了获得最大的生长速度,每种营养成分的最-佳浓度可以有相当大的变化。当矿物盐溶解在水中时,他们被解离。培养基中的活化因子是不同种类的离子,而不是化合物。因此,通过对培养基中不同种类离子浓度的测定,就可以对两种培养基做出比较。在大多数情况下,一种营养培养基所含的无机氮在25~60mmol/L之间。细胞能够在硝酸盐单独存在的情况下生长,但是在更多的情况下,铵或者其他还原态氮对植物的生长又明显的好处。另外,当培养基中仅含硝酸盐时,pH会升高。当培养基中同时含有硝酸盐和少量的铵化合物时,pH的这种变化就会被抑制。硝酸盐和铵的应用范围分别在25~40mmol/L和2~20mmol/L。对铵的响应得变化从抑制到必需依赖于组织类型和培养目的。在铵的量超过8mmol/L的情况下,或者组织生长在仅含这种氮素的培养基中时,培养液中也应该含有柠檬酸盐、苹果酸、琥珀酸或者其他TCA循环中的酸。大多数植物选择硝酸盐而不是铵,相反的情况也存在于另外一些植物中。钾的需要浓度为2~26mmol/L,钾一般以硝酸盐或氯化物的形式提供,钠不能代替钾。浓度为1~3mmol/L的Ca、硫酸盐、磷酸盐和Mg通常能满足要求。培养基中的Fe通常以螯合物的形式加入,当pH达到8时,这种形式的Fe仍可利用。

      2、碳源和能源:没有例外,标准碳源是蔗糖或葡萄糖。果糖也可以作为碳源,但是效果要差一些。培养基中的蔗糖可以迅速地转化为葡萄糖和果糖。葡萄糖首先被利用,然后是果糖。培养基中的蔗糖浓度一般为2%~5%。其他的碳水化合物,包括乳糖、麦芽糖、半乳糖和淀粉也被使用做碳源,但是这下化合物的效果一般比蔗糖和葡萄糖差。大多数培养基含肌醇,其浓度约为100mg/L。肌醇可以改善细胞的生长。

      3、维生素:正常植物(相对离体植物而言)可以合成其生长和发育所需要的维生素。但是,植物细胞的体外培养需要在培养基中加入维生素。维生素B1是植物生长和发育所必需的。烟酸和维生素B6可以改善细胞或离体植物的生长。一些培养基中含泛酸、生物素、叶酸、对氨基-苯甲-酸、氯化胆碱、核黄素和抗坏血酸。

      4、生长调节剂:激素是高等植物合成的有机化合物,它们影响植物的生长和发育。植物激素的量很小,而且通常在产生它们的部位以外的地方作用。除了自然化合物,人们还合成了与自然激素相同的化合物。所有这些激素统称为生长调节剂。主要的生长调节剂有两类,它们在职务组织培养中具有特殊的重要性: ⑴生长素   生长素的共同特点是它们具有能导致细胞分裂和形成愈伤组织的性质。生长素引起细胞分裂、细胞生长和组织增大及不定根的形成。它经常抑制不定芽和腋芽的形成。当生长素的浓度较低时,不定根的形成占主导地位,然而,当生长素的浓度较高时,愈伤组织能够形成,而根不能够形成。最-常用的高效化合物是2,4—二氯-苯氧乙酸(2,4—T)。其他可以使用的生长素是萘乙酸(NAA)、吲哚丁-酸(IBA)、2,4,5—三氯-苯氧乙酸(2,4,5—T)、对氯-苯氧乙酸(pCPA)和毒莠定。 ⑵细胞分裂素   细胞分裂素是腺嘌呤的衍生物,它对诱导芽的产生具有重要作用。最-常用的细胞分裂素有激动素、苯甲基嘌呤(BA)或6—苄氨基嘌呤(BAP)、玉米素和异戊烯基嘌呤(2iP)。这些化合物通常被用于刺激植物生长和发育。当把它们和生长素一起使用时,通常可以促进细胞分裂,高浓度的(1~10mg/L)时可以诱导不定芽的形成,但是根的形成一般被抑制。它们通过降低顶端优势促进侧芽的形成。 ⑶其他激素  赤霉素通常被用于植株的再生。一般情况下,赤霉素可以使节间生长、引起离体分生组织或芽的生长。赤霉素通常抑制不定根和不定芽的形成。 脱落酸是诱导胚形成的一个重要的生长调节剂。

      5、有机添加剂:培养的正常细胞能够合成其所需要的所有氨基酸,但是,当其中含有氨基酸(如谷氨酸)形式的有机氮和核苷酸存在时是有益的。外加氨基酸要慎重,因为这些氨基酸可能成为抑制剂。

      6、胶凝剂:琼脂是一种最-常用的凝固剂,它在组织培养中作为支撑物。琼脂的浓度过低,与水的亲和力不强,难以形成有效的支撑;琼脂的浓度过高,培养基就会变硬,妨碍营养向组织中扩散,离体生长将受到负面影响。 有支撑物的液体培养基可以取代固体培养基: ①不含琼脂的液体培养基,以干净的泡沫塑料、玻璃纤维为支撑物 ②悬挂在液体培养基中的过滤纸桥 ③生长在有玻璃珠的液体培养基中 ④位于滤纸下的纤维胶海绵代替琼脂作为液体培养基的载体

      7、pH:pH决定着生物大分子的结构和活性的许多方面。对于外植体的离体培养,合适的营养培养基的pH值为5.0~6.0。一般情况下,pH﹥7.0或pH﹤4.5时,生长和发育停止。培养基的pH在消毒前和消毒后不相同,一般情况下,经过高压消毒后的培养基,其pH值回降低0.3~0.5。pH﹥6.0时,可以得到硬度合适的培养基,而pH﹤5.0时,琼脂就不能形成令人满意的凝胶。

      主要试剂

      详见实验步骤。

      主要设备

      镊子、解剖刀、培养皿、 苗瓶、 酒精瓶、  超净工作台、三角瓶、电炉等;

      实验材料

      种苗( 从分生部上沿切取一段约25px左右的种苗茎,切好的外植体上应保留一片苗叶,若叶片上有萎黄部位,切除之),详见实验步骤。

      实验步骤

      1、向烧杯中顺序加入培养基母液: 大量元素 25ml    微量元素 2.5ml    铁盐 2.5ml    维生素、肌醇和甘氨酸各2.5ml    BA和NAA各2.0ml

        2、加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水,加入10g蔗糖和3.5g琼脂,将烧杯置于电炉上,搅拌加热使琼脂完全溶化,然后用蒸馏水准确稀释至500ml,继续加热几分钟使之混合后分装于10个100ml三角瓶中,以封口膜封口,用记号笔写上学号和姓名。 分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌,灭菌条件为温度121℃,压力1.1kg/cm2,灭菌时间20min左右,灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。

        3、将超净工作台用75%的酒精擦拭一遍,实验中需要用到的器具(镊子、解剖刀、培养皿)和装培养基的三角瓶也用75%的酒精擦拭一遍后置于超净工作台中。打开紫外灯和风机,处理20-30分钟。

        4、双手用肥皂洗净,再用75%酒精擦拭一遍后,连同用75%酒精擦拭过的种苗瓶一起进入超净工作台。进入超净工作台后,不得随意出入,以免染菌。实验过程中应尽量避免手直接接触。

        5、点燃酒精灯,将镊子和解剖刀在灯焰上烘烤后,插在酒精瓶中;在灯焰附近打开种苗瓶封口,从酒精瓶中取出镊子和解剖刀,灯焰上烘烤后切取种苗于培养皿,使用过的镊子和解剖刀放回酒精瓶(实验中使用镊子和解剖刀前均需在灯焰上烘烤灭菌,使用完后放回酒精瓶;在接种时,镊子应尽量多烘烤一段,以防镊子插入过深时,致使培养物染菌);瓶口和封口膜内侧灯焰上烘烤后封口;实验过程中应尽量避免手直接接触外植体材料。

        6、从分生部上沿切取一段约25px左右的种苗茎,切好的外植体上应保留一片苗叶,若叶片上有萎黄部位,切除之。

        7、在灯焰附近打开培养基瓶封口,接种过程中,培养基瓶口应一直对准灯焰,手不得接触封口膜内侧;将切好的外植体材料垂直插入培养基中,一瓶接种1-2个。此过程应尽快完成后封口。

        8、接种好的三角瓶24℃培养。2天后观察,若有染菌需重做。一周后愈伤组织可形成。继续分两组培养:一组24℃光照培养,另一组24℃黑暗环境下培养,观察两组培养物再分化情况。

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