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免疫荧光技术操作步骤

  • 发布日期:2021-01-05      浏览次数:37
    • 基本原理
      将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少,相对使用标记抗体用量偏大。
      试剂与仪器
      磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
      荧光标记的抗体溶液:以 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 进行稀释
      缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制
      搪瓷桶三只(内有 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 1500ml)
      有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)
      荧光显微镜
      玻片架
      滤纸
      37℃温箱等。


      实验步骤
      1. 滴加 0.01mol/L,pH7.4 的PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持一定湿度。
      2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温一
      30min
      定时间(参考:30min)。
      3. 取出玻片,置玻片架上,先用 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 冲洗后,再按顺序过 0.01mol/L,
      pH7.4 的 PBS 三缸浸泡,每缸 3-5 min,不时振荡。
      4. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。
      5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:
      (-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光明亮;(+++
      --++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)
      或(-),即可判定为阳性。
       
      注意事项
      1. 对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释在 1:20-100 之
      间,要自行摸索最-佳梯度,建立最-好的稀释比例,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,
      影响结果的观察。
      2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从 10 min 到数
      小时,一般 30 min 已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于 37℃可加强染色效果,
      但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用 0-2℃的低温,延长染色时间。低温染
      色过夜较 37℃30 min 效果好的多。
      3. 为了保证荧光染色的正确性,首次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧光染
      色的干扰。
      (1)标本自发荧光对照:标本加 1-2 滴 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS。
      (2)特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗
      体。
      如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光, 待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。
      4. 一般标本在高压汞灯下照射超过 3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本最-好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。

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