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慢病毒RNAi干扰实验原理

  • 发布日期:2021-03-12      浏览次数:58
    • (1)原理
      慢病毒是逆转录病毒的一种,具有逆转录病毒的基本结构,但也有不同于逆转录病毒的组份和特性,作为基因治疗载体发展起来,z近已用于转基因动物制备。利用慢病毒构建的shRNA/miRNA载体,与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比。
      一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用,另一方面,lentivirus-shRNA/miRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达。

       

      (2)服务流程
      1)含目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和纯化提取;
      2)慢病毒干扰载体、pGag/Pol、pRev、pVSV-G四质粒共转染293T细胞;
      3)培养48~72h,收集培养上清;
      4)病毒的纯化和浓缩(超离和/或超滤);
      5)滴度测定、目的基因检定
      6)将制得的慢病毒液转导客户的靶细胞,筛选混合稳定细胞株,并检测靶基因的表达。

      客户提供
      1)表达miRNA/shRNA的质粒(提供测序图谱)或所要Knockdown的靶基因的名称、序列;
      2)所需要的病毒滴度及总量,病毒是否需要纯化
      3)若需要检测靶基因的表达变化,如需要请提供相应的抗体

      我们提供
      1)提供重组后的慢病毒载体质粒
      2)提供已测定好滴度、可以直接进行后续分析的慢病毒储存液

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