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转移电泳实验技术操作方法

  • 发布日期:2021-03-26      浏览次数:128
    • 原理:转移电泳是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离出的蛋白质谱直接转移到硝酸纤维膜上,而形成固定相,并同时排除各种干扰物质,保持其天然构象和生物学活性,完成在凝胶中难以进行的各种生物试验。

      材料

      1.琼脂 糖

      2.丙烯酰胺

      3.甲叉双丙烯酰胺

      4.十二烷基磺酸钠(SDS)

      5.硝酸纤维膜滤纸 孔径0.45μm

      6.琼脂糖凝胶电泳缓冲液 0.89mMol/L Tris—89mmol/L 硼酸—2.5mMol/L EDTA (pH8.3)。

      7.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液 0.05Mol/L Tris—0.384Mol/L 甘氨酸—0.1%SDS(pH8.3)。

      8.蛋白质转移电泳缓冲液 25mMol/L Tris—192mMol/L 甘氨酸—20%甲醇(pH8.3)。

      9.溴乙啶溶液 称取5mg溴乙啶,用无离子水溶解。定容到10ml,取1ml稀释到1 000ml,最终浓度为0.5μg/ml。10.考马斯亮兰R-250染色液 0.25%考马斯亮兰R-250-10%醋酸-45%甲醇。

      11.氨基黑染色液 在含10%醋酸的甲醇中加入氨基黑10B至饱和。

      12.垂直板型及水平板型凝胶电泳槽

      13.转移电泳槽

      14.直流稳压电源0V~800V,0mA~100mA

      操作方法

      1.SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳(垂直板型)分离蛋白质。

      ⑴凝胶的制备:丙烯酰胺 15.00g ;甲叉双丙烯酰胺 0.40g ;0.37Mol/L Tris—HCl(pH8.3)50ml ,此为丙烯酰胺母液,过滤后4℃保存备用。丙烯酰胺母液 8.30ml ;N、N、N、N—四甲基乙二胺(DEMED)250μl ;10%SDS 0.25ml ;0.375Mol/L pH8.8 Tris-HCl16.45ml 混合即为10%分离胶。

      丙烯酰胺母液 1.30ml;TEMED 15.00μl ;10%SDS 0.10ml ;0.125Mol/L pH6.8Tris-HCl8.60ml 制成4%浓缩胶。

      将分离胶与浓缩胶真空抽气10min~15min,备用。

      ⑵凝胶板的制备及加样:取1%的琼脂将凝胶膜底部的缝隙封固。在10%的分离胶中加入10%过硫酸铵0.25ml,混匀后,立即沿玻璃壁缓缓加入胶膜中,上端留出5cm的高度,然后用带有细针头的注射器轻轻地向胶面加入蒸馏水,静置数分钟,水胶界面消失,约20min~30min界面清晰(凝胶已聚合),用注射器将水吸出,并用滤纸吸干余水。在4%浓缩胶中加入10%过硫酸铵0.4ml,混匀后,沿玻璃壁缓慢倒入已聚合的分离胶的上面,立即插进样品槽模板。待凝胶聚合后(约20min~30min),轻轻拔出样品槽模板。将电泳缓冲液加入上、下电泳槽。将分离的蛋白质样品用0.01Mol/L Tris-HCl(pH8.0)-0.001Mol/L EDTA-1%SDS-5%硫基乙醇溶液作1︰1稀释,100℃加热处理3min之后,加入甘油10%及适当量溴酚兰,用微量注射器将样品注入样品槽中,蛋白质最后浓度一般为0.05mg/ml~1mg/ml。

      ⑶电泳:上端接阴极,下端接阳极。电压120V、电流30mA,电泳时间5h~6h,待染料泳至距底部约1cm处时断电。

      ⑷染色:切下一部分凝胶,用考马斯亮兰R-250染色作为对照。其余部分作转移电泳。

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