首页 >> 技术文章 >> 什么是反向PCR(inverse PCR)

什么是反向PCR(inverse PCR)

  • 发布日期:2021-04-22      浏览次数:18
    • 反向PCR(inverse PCR)

      反向PCR是一种多 聚合酶 链式反应(PCR)应用的方法,可使已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA,以产生适合于PCR扩增大小的片段,然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区的末端序列,但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列,还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。

      用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由 PCR扩增片段的大小决定,目前,PCR扩增的实际上限为3-4 kb。在许多情况下,首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或上游区,而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增,并带有由内切酶和环化类型决定的接点(例如,互补突头连接与钝头连接)。对于扩增左翼或右翼序列,初试时蕞好靠近识别多个碱基位点的酶,并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针,建议事先在载体中引入合适的酶切位点。

      用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中,为产生对反向PCR大小适当的DNA片段需要两种内切酶,但这样所产生的片段末端则不适于连接,环化前需用Klenow或噬菌体T4 DNA 聚合酶 修理(钝化)。连接前,需用酚或热变性使内切酶失活。

      聚合酶链反应条件与经典所用的相同,例如,94℃-30秒变性,58℃-30秒引物退火,Taq聚合酶70℃延伸3分钟,进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向 PCR用于测序时,与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用,它使测序引物扩增部分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近,减少了扩增引物的干扰

    网站首页 | 走进我们 | 新闻中心 | 产品中心 | 技术文章 | 联系我们

    地址:上海市嘉定区曹安公路5588号   技术支持:安防展览网   sitemap.xml   

    ©2021 昆山远慕生物科技有限公司版权所有   备案号:苏ICP备2020054465号-1

    在线客服 联系方式 二维码

    服务热线

    021-58999013

    扫一扫,关注我们