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免疫荧光染色及注意事项

  • 发布日期:2021-05-11      浏览次数:139
    • 免疫荧光染色:

      (1)冰冻切片用0. 01 moUL PBST(或PBS)漂洗或冲洗3次,每次5min。

      (2) 3% H2O2孵育10min,再用0. 01 mol/L PBS冲洗3次,每次5 min。

      (3) 5%一8%的正常动物血清(山羊或马血清)孵育30-60min。

      (4)洗掉血清,滴加一抗(0. 01 mol/L PBS配制),4℃过夜。

      (5)吸出一抗,0. 01 mol/L PBS冲洗3次,每次5 min,加入荧光标记的二抗(0. 01 mol/L PBS配制),4℃过夜。

      (6)吸出二抗,0. 01 mol/L PBS冲洗3次,每次 10min。

      (7)封片剂封片,荧光显微镜观察照相。

      注意事项:

      (1) 由于荧光容易淬灭,一般仅能维持几个小时,因此,荧光二抗应避光保存,即从加入荧光二抗以后的步骤中都要尽量避光操作。封片后应尽早照相,目前有市售的荧光增强剂,可使荧光在4℃保存1-2周仍不淬灭。

      (2) 常用的荧光素有以下几种,绿色荧光:FITC、 Alexa Fluor 488和GFP;红色荧光:TRITC、Cy3、Alexa Fluor 568&594和MitoTrackerRed;蓝色荧光:Hoechst、DAPI;黄色荧光:YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。

      (3)不同的荧光素激发的波长不同,因此,选用滤光片时要注意。一般紫外线的激发波长为334-365nm,蓝光的激发波长为435-490nm,绿光的激发波长为546nm左右。

      (4) 荧光显微镜应提前至少15 min打开汞灯预热。关闭30min后方可再开启。

      (5)免疫荧光的组织要求很高,载玻片及盖玻片要干净无杂质。进行荧光染色时,需注意染液的pH、浓度和染色温度,还要避免对荧光有熄灭作用的物质的接触。组织和细胞也有自发荧光,如红细胞中的血红蛋白呈红色荧光,维生素A呈绿色自发性荧光等。

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