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初学者如何做好蛋白表达?@远慕技术

  • 发布日期:2021-05-13      浏览次数:121
    •   重组蛋白表达技术可以用来分析基因调控以及研究蛋白质结构和功能。无论是体内功能研究还是用于结构研究的大规模生产,以及生物治疗领域的药物开发都需要用到蛋白表达技术。
       
        1、蛋白质通用合成路径
       
        DNA —>mRNA—> 蛋白
       
        实际操作流程为:
       
        1. 克隆或合成目的基因
       
        2. 载体构建
       
        3. 蛋白表达与纯化
       
        4. 蛋白的大量表达与纯化(或无)
       
        2、克隆或合成目的基因
       
        典型的表达载体包括至少4个主要元件:
       
        目的基因表达框(包括启动子和基因终止或 poly (A) 信号)
       
        细菌的复制起始点(ori)
       
        特定宿主的抗生素选择框(如潮霉素 B、霉酚酸、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素 S 等)
       
        大肠杆菌的抗生素选择框(如氨苄青霉素、杀稻瘟菌素 S、羧苄青霉素、Zeocin 选择性抗生素抗性等)
       
        其他元件还包括:
       
        多克隆位点(MCS)(即多酶切接头)
       
        表位标签
       
        分泌信号
       
        蛋白酶识别位点
       
        内部核糖体插入位点(IRES)
       
        3、不同蛋白表达系统选择
       
        蛋白表达是许多小伙伴的实验课题中的主要内容。由于涉及不同的研究领域,表达载体多种多样,每个人要表达的蛋白特性更是千差万别,特别是一些小伙伴是第1次做课题,关于怎样表达蛋白,怎样安排实验步骤更是一头雾水。这里按照不同表达载体,列举蕞常用的重组蛋白表达方案。对每一种蛋白表达案例从实验步骤、大只需用时间以及每个步骤需要完成的目标进行比较,大家可以对照自己的实验内容,希望能有所帮助。
       
        4、常用的蛋白表达(含细胞株的制备):
       
        CHO 稳定细胞株开发
       
        HEK293 稳定细胞株开发
       
        原核蛋白表达
       
        哺乳动物细胞瞬时表达
       
        酵母蛋白表达
       
        杆状病毒与昆虫细胞蛋白表达
       
        5、重组蛋白技术方案
       
        1. CHO 稳定细胞株开发
       
      2. HEK293 稳定细胞株开发
       
      3. 原核蛋白表达流程
       
      4. 哺乳动物细胞瞬时表达流程
       
      5. 酵母蛋白表达流程
       
      6. 杆状病毒 - 昆虫细胞蛋白表达流程
       
      6、不同蛋白表达之比较
       
        以上实验方案的完成时间是较为成熟的实验室的工作流程用时,小伙伴可以根据自己的实验安排灵活掌握。完成目标也应该根据自己的课题要求进行适当增减。

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