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植物细胞组织培养外植体的灭菌

  • 发布日期:2021-05-19      浏览次数:126
    • 外植体灭菌是植物细胞组织培养重要的工作之一。接种用的材料表面,常常附有多种多样的微生物,这些微生物一旦带进培养基,就会迅速滋生,使实验前功尽弃。因此,材料在接种前必须进行灭菌。灭菌时,既要将材料上附着的微生物杀死,同时又不能伤及材料。因此,灭菌采用何种药剂,什么浓度,处理多长时间,均应根据材料对药剂的敏感情况来确定。

      与灭菌相关的一个概念是消毒,它指杀死、消除或充分抑制部分微生物,使之不再发生危害作用,显然经过消毒,许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死,即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物,所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台等)和使用的器皿,以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作,就叫作无菌操作。一般来说,外植体接种的过程都是在无菌的环境里进行的,因此,外植体接种前都必须彻底灭菌。

      用于植物外植体灭菌的灭菌剂有升gong、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂bai粉、次氯酸钠、抗生素、酒精等。使用这些灭菌剂,都能起到表面杀菌的作用。现将主要灭菌剂常用浓度和灭菌效果列出,其中70%~75%的酒精有较强的杀菌力、穿透力和湿润作用,可排出材料上的空气,利于其他消毒剂的渗入,常与其他消毒剂配合使用。酒精穿透力强,易损伤材料,所以一般处理时间要短。

      上述灭菌剂应在使用前临时配制,氯化gong可短期内贮用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的,故灭菌时用广口瓶加盖较好;升gong是用重金属汞离子来灭菌的;过氧化氢是分解释放原子态氧来杀菌的,这种药剂残留的影响较小,灭菌后用无菌水漂洗3~4次即可;由于用升gong液灭菌的材料,难以对升gong残毒有效去除,所以应当用无菌水漂洗8~10次,每次不少于3min,以尽量去除残毒。

      灭菌时,把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间,倒入灭菌溶液,不时用玻璃棒轻轻搅动,以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡,使灭菌彻底。在快到时间之前1~2min,开始把灭菌液倾入一备好的大烧杯内,要注意勿使材料倒出,倾净后立即倒入无菌水,轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始,至倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较灭菌效果,以便改正。灭菌液要充分浸没材料,宁可多用些灭菌液,切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。

      在灭菌溶液中加吐温80效果较好,这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布,更容易浸入到灭两的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加,应注意吐温的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的0.5%,即在100mL加入15滴。

      最后一步是用无菌水漂洗,漂洗要每次3min左右,视采用的消毒液种类,漂洗3~l0次。无菌水漂洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。

      外植体的灭菌工作应在接种室或接种箱内无菌的条件下进行,各种不同类型的材料灭菌方法如下,

      (1)花药的灭菌用于组织培养的花药,按小孢子发育时期要求,实际上大多没有成熟,花药外而有萼片、花瓣或颖片、稃片保护着,通常处于无菌状态。所以一般只对整个花蕾或幼穗进行体表灭菌即可。如茄(solanumrnelongennaL)的花药,灭菌时先去掉花蕾的萼片,用70%酒精擦洗花瓣,然后将整个花蕾浸泡在饱和漂bai粉上清液中10min,再经无菌水清洗2~3次,即可接种。这一灭菌程序,也适用于其他植物花药的灭菌。

      (2)果实和种子的灭菌根据果实和种子清洁程度,用自来水冲洗10~20min甚至更长时间,然后进行消毒。

      荚果的灭菌;绿色荚果可以采用火焰杀菌法。将绿色荚果稍加洗涤,转入95%酒精中,然后取出荚果放入灭菌的培养皿中,点燃灼烧,并不断翻转荚果,待表面酒精燃尽,即可获得无菌荚果。再在无菌条件下取出幼胚或种子用于接种。火焰灭菌具有简便、快速、经济、彻底之优点。该程序也适用于块根类外植体的灭菌。

      种子灭菌:通常首先用热水浸种,然后再用次氯酸钠或氧化gong等杀菌剂灭菌。热水浸种除具有增加种皮透性、打破种子的休眠、促进种子萌发的作用外,高水温也有一定的杀菌作用。浸种的水温和时间与种子的大小、干燥程度以及种皮厚度有关。

      具体步骤是用自来水冲洗10~20min,再用75%酒精消毒1~2min,再用2%次氯酸钠溶液浸泡5min,后用无菌水冲洗3~5次,就可以去除种子的病菌,进行组织培养。

      果内种子则先要用10%次氯酸钙浸泡20~30min,甚至几小时,依种皮硬度而定。对难以消毒的还可以用0.1%升gong或1%~2%溴水消毒5min。对用胚或胚乳培养的种子,如种皮太硬的种子,也可预先去掉种皮,再用4%~8%的次氯酸钠溶液浸泡8~l0min,经过无菌水冲洗后。在无菌条件下取出外植体即可用于接种,这类外植体一般都不带污染微生物。

      (3)茎尖、茎段及叶片的灭菌灭菌方法与花药的灭菌方法相同。对于茎叶,因为暴露在空中,且生有毛或刺等附属物,所以灭菌前应该用自来水冲洗干净,用吸水纸将水吸干,再用70%酒精漂洗一下。然后,根据材料的老、嫩和枝条的坚硬程度,用2%~10%次氯酸钠溶液浸泡6~15min,用无菌水冲洗3次,用无菌纸吸干后进行接种。

      (4)根和贮藏器官的灭菌这类材料大多埋于土中,材料上常有损伤及带有泥土。灭菌比较困难。灭菌前,要用自来水清洗,并用毛刷或毛笔轻轻刷洗掉污物,必要时用刀片切去损伤和污染严重部分,吸于多余水分后用70%酒精漂洗一下,再用0.1%~0.2%的氯化gong灭菌5~10min,或用6%~8%次氯酸钠溶液浸5~15min,接着用无菌水清洗及用无菌纸吸干,然后进行接种。

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