首页 >> 技术文章 >> 蛋白样品制备方法学评估

蛋白样品制备方法学评估

  • 发布日期:2021-06-15      浏览次数:61
    • 蛋白质样品的制备,是蛋白质研究的第一步,不论后续采用何种分离或鉴定手段,样品制备都是重要步骤。

      蛋白质样品制备的意义

      生物的蛋白质种类多达 10 万种以上,样品中的蛋白质种类也可达到1万种以上,但大部分蛋白质的拷贝数很少,因此通过样品制备起到浓缩蛋白质的作用。

      去除样品中各种非蛋白质的影响。

      如何进行蛋白质的制备

      蛋白样品制备包括蛋白质的分离,提取和纯化。从各类研究角度而言,样品制备都要尽可能获得所有样品中的蛋白质,但是由于蛋白质种类多,丰度不一,物化特性多样等因素,要到达真正的完全蛋白质制备是非常困难的。

      在制备中丢失的蛋白是永远不可能在后面试验中弥补回来的!

      样品制备的原则:

      尽可能采用简单的方法进行样品的制备。

      尽可能提高样品的溶解度,使所有待分析的蛋白质样品全部处于溶解状态,且稳定可重复。

      尽可能减少蛋白的降解。

      根据下游实验选择决定提取蛋白的方法,例如提取变性还是活性蛋白,提取总蛋白还是亚细胞结构组分蛋白。

      尽量去除干扰下游应用的杂质,包括但不仅限于核酸,组织碎片,或某些高丰度无关蛋白。

      样品制备的基本流程:

      样品的破碎

      样品的裂解

      杂质的去除及蛋白质溶液的获取

      样品的破碎

      为了完全分析细胞内蛋白,样品必须经过有效的破碎,破碎方法的选择依赖于样品来源不同(如组织,固定组织,难研磨组织,脂肪,菌体)而不同,同时也依赖于提取蛋白的类型(如是获取总蛋白还是特殊的亚细胞结构组分)。

      通常组织样品和微生物样品都需要进行破碎处理,而细胞样品不需要。破碎可以通过渗透,冻融,酶解,超声,高压,液氮研磨,机械匀浆,玻璃珠匀浆等方式完成。选择破碎方式时也要考虑使用的裂解液配方是否可以wan美的配合,以得到蕞佳的提取效果。提取总蛋白时需要尽量的破碎样品释放蛋白,而特殊的亚细胞结构分离则需要根据提取方法采用合适的破碎方式。

      提示:内源性的蛋白酶通常存在于细胞质内,在细胞破碎时可能会释放出来,导致某些蛋白质的降解,从而影响下游实验结果,因此可在细胞裂解前添加蛋白酶抑制剂加以保护。

      样品的裂解

      样品裂解是指对蛋白质进行增溶性溶解的过程,可通过破坏蛋白质与蛋白质,蛋白质与非蛋白质之间的相互作用完成。通常裂解液中会添加表面活性剂,不同的裂解液配方所能溶解和获取的蛋白种类和得率会有较大差别,所得到的蛋白谱也会不同,所以看似简单的样品裂解却是决定整个实验成败的关键点。优质的裂解液配方既能实现蛋白质间的良好分离,又不影响下游实验。

      去除杂质和蛋白质获取

      蛋白样品中的杂质主要包括核酸,脂类,组织碎片等,这些杂质均会干扰下游实验。特别是核酸杂质会增加样品的粘度,可能会引起下游实验中凝胶孔堵塞,核酸与蛋白结合阻碍聚集,银染或 WB 背景过高等问题,所以需尽量去除杂质。去除杂质后即可获得蛋白质溶液。传统的提取方法(如RIPA裂解液和溶液法提取的试剂盒)缺少有效的杂质去除步骤,通过离心取上清的方式获取的蛋白质无法完全去除杂质,且获得的蛋白纯度较低,同时也会损失较多蛋白质,从而影响蛋白的提取质量,改变样品中真实的蛋白谱。

      亚细胞结构分离

      大部分实验通常可以用总蛋白组分进行蛋白质的分析,但是涉及到某些低丰度蛋白或者蛋白细胞定位和蛋白转运研究时,则需要进行样品的亚细胞结构分离,也就是将样品中的蛋白分成几个组分,分别进行蛋白质的研究。根据蛋白质在细胞中不同的细胞定位进行分离,可分离细胞核,细胞膜,内质网,线粒体,高尔基体,溶酶体,内体等结构。亚细胞结构分离不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量,降低检测难度,还可以针对某一细胞组分的蛋白质进行分析。

      传统的亚细胞结构分离主要是将样品匀浆后,进行密度梯度离心分离不同组分,传统提取方法操作步骤多而复杂,所需起始原料量极大,需使用超高速离心及配制密度梯度溶液,得率较低,失败率高,使得下游实验困难增加,阻碍深入研究进程。为了加速科研者在蛋白领域深入研究的脚步,Invent 打造了柱式法亚细胞结构分离平台,配有全套的动植物亚细胞结构分离工具,可分离内质网,高尔基体,溶酶体,线粒体,内体,细胞膜,叶绿体,外泌体,微粒体,细胞核等,仅需极少的样品,无需超高速离心,即可获得高质量的亚细胞结构。
       

    网站首页 | 走进我们 | 新闻中心 | 产品中心 | 技术文章 | 联系我们

    地址:上海市嘉定区曹安公路5588号   技术支持:安防展览网   sitemap.xml   

    ©2021 昆山远慕生物科技有限公司版权所有   备案号:苏ICP备2020054465号-1

    在线客服 联系方式 二维码

    服务热线

    021-58999013

    扫一扫,关注我们