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菌种保藏原理与步骤!

  • 发布日期:2020-09-25      浏览次数:61
    • 菌种代号的意义

      国内常见微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或 CMCC(B)

      CMCC -- 中国医学菌种保藏中心

      B -- 代表细菌, F --代表真菌。

      大肠杆菌[CMCC (B) 44102];

      乙型副伤寒沙门杆菌[CMCC (B) 50094];

      铜绿假单胞菌[CMCC (B)10104];

      金黄色葡萄球菌[CMCC (B)26003];

      生孢梭菌[CMCC(B)64941];

      白色念珠菌[CMCC(F)98001]。

      常用菌种保藏方法

      (一) 菌种保藏的原理

      根据微生物的菌种生理、生化特性,在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度,使细胞基本处于休眠状态,生长繁殖受到抑制但又不至于死亡,以减低菌种的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。

      低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。

      选择保藏方法时,首先应考虑方法能否长期地保持菌种原有的特性,同时也应兼顾到方法的经济和简便。在实际工作中,往往多种条件同时使用,以提高保藏效果。

      (二)菌种保藏步骤

      ① 挑选特征典型的纯菌菌落;

      ② 确定保藏的合适菌体形态;

      ③ 选择最适宜的保藏方法;

      ④ 定期对保藏菌种进行检查,观察是否发生变化,若有变化,须改变保藏方法。保藏期满应及时进行移种。

      1.琼脂斜面低温保存法

      (1)方法:将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面(某些特殊菌种可用液体培养基)上,按规定的温度和时间培养,待充分生长后,把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好,为减缓培养基的水分蒸发,延长保藏时间,可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3个月移种一次,继续进行保藏。若用半固体高层培养基穿刺培养,一般可保藏半年 ~ 一年。有的甚至更长时间。

      (2)适用范围:细菌、酵母菌、霉菌保藏。

      (3)特点:优点是--简便,易于推广;一般不需要另选择保藏用培养基;对大多数微生物都适用;缺点是--保藏期太短;传代次数多,易发生变异及污染。

      (4)注意事项:保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物,至少应是第三代的培养物。

      保藏时,破伤风杆菌可用庖肉培养基;生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉,如有异常应及时处理。

      每次移植后,应与原菌种的编号、名称逐一核对,确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。

      保藏菌种的培养基应无糖,其他菌类含糖小于2%为宜,以免产酸过多,影响菌种存活。

      铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡,不宜用本法保存。

      2. 液体石蜡保存法

      本法是用石蜡将培养物与空气隔绝,以降低菌种的生理生化水平,并可防止水分蒸发,从而延长菌种的保藏期。

      (1)方法:将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~0.5 %琼脂半固体高层培养基中,培养好备用。取化学纯的液体石蜡装在试管中,每管10~15mL,加棉塞,瓶口包上纸,121℃高压灭菌30min,取出置37℃温箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器内除去液体石蜡中的水分。

      将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内,液体石蜡液面以高出培养基最上端1㎝为宜,将试管直立,放入4℃冰箱中保藏。

      (2)适用范围:适用于保藏部分霉菌,酵母菌和放线菌,对细菌保藏效果较差。

      (3)特点:本方法简便易行,是实验室常用的一种保藏方法,该法主要使菌种与空气隔绝。

      (4)注意事项:

      ① 保藏时,用新鲜培养物接种,应检查纯度和特征后,方可进行保藏;

      ② 保藏过程中,需经常观察斜面是否干燥,如干燥, 需重新移种;

      ③ 使用菌种时,先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边,再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养,待长出新培养物后,再移种一次到新斜面上即可使用;

      ④ 将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻,再烧灼灭菌,以免直接在酒精灯下烧灼时,液体石蜡四溅,引起污染;

      ⑤ 液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制,如太多,会影响菌种交换气体,使保藏效果不好;如太少,斜面容易干燥,将缩短保藏期。一般以高出斜面1cm为宜;

      ⑥ 制备无菌液体石蜡时,每管装量不能太多,否则分装到菌种培养基中易造成污染。

      菌种的复苏与保存

      菌种的复苏与保存应在专用超净工作台或生物安全柜内进行。

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