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细胞培养中支原体污染的预防和清除

  • 发布日期:2020-10-20      浏览次数:43
    • 支原体污染是细胞培养中一个很常见的问题,可能有高达87%的细胞系发生过支原体污染。支原体是一种直径约为0.2-0.8 μm,无细胞壁的原核生物,具有变形能力,可透过常见过滤膜(0.22-0.45 μm),常规的无菌过滤方法不能将其去除,细胞培养常用的青霉素和链霉素也不能清除培养物中的支原体。支原体污染能改变细胞的DNA、RNA和蛋白质的合成,引起染色体异常,尤其是会改变宿主细胞表面膜蛋白抗原性。

      由于支原体污染能影响几乎每一个细胞参数,所以很多研究都强调常规筛选研究细胞系的需要,以确保观察到的结果不被污染所损害。

       

      一,支原体污染的预防

      预防是防止细胞培养过程中发生污染的最-好办法。只有预防工作做在前,才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手。

      1.从物品、用品消毒灭菌着手

      细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底,各种溶液灭菌除菌要仔细,并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。

      2、从操作者做起

      (1)操作者责任心要强,要细心稳重,操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟,按规定穿隔离衣。进入后关好门,坐下来尽量少走动。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。事先要严格检查器材、溶液和培养物,不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内,更不能随便使用,以免造成大批污染。

      (2)操作者动作要轻,必须在火焰周围无菌区内打开瓶口,并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话,若打喷嚏或咳嗽应转向背面。

      (3)操作时要常更换吸管,切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾,保持实验室清洁整齐,最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。

      3.防止细胞交叉污染

      (1)在进行多种细胞培养操作时,所用器具要严格区分,最-好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作,避免一起进行时易发生混乱。

      (2)在进行换液或传代操作时,注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口,以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。

      (3)所有细胞一旦购置,或从别处引入,或自己建立,均应及早留种冻存,一旦发生污染可弃之复苏,重新培养。

      二,支原体污染的清除

      培养细胞一经污染,多数较难处理。如果污染细胞价值不大,宜弃之。有细胞株留存的或可购置的,可在寻找原因后彻底消毒操作室,复苏或重新购置细胞,再培养。若污染细胞价值较大,又难于重新得到,可采取以下办法清除。

      1.使用抗生素

      抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL),污染后清除用药需采用大于常用量5~10倍的冲洗法,于加药后作用24~48小时,再换常规培养液。

      此法在污染早期可能有效。所用抗生素品种除青霉素、链霉素外,还可用庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四环素、制霉菌素等。常用400~800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四环素处理,每隔2~3日换液1次,传1~2代进行治疗。近年来有报道,4-氟,2-羟基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilinderivative, BM-Cyclin2:BM-1和四环素衍生物(BM-2)等三种抗生素单用或合用对杀灭支原体有效。

      2.加温处理

      将污染的组织培养物放在41℃培养18小时,可杀死支原体,但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验,摸索能最大限度杀死支原体又对细胞影响最小的加热时间。此法有时不可靠。若先用药物处理后,再以41℃加温处理效果更佳。

      3.使用支原体特异性血清

      用5%的兔支原体免疫血清(血凝效价1:320以上)可去除支原体污染,因特异抗体可抑制支原体生长,故经抗血清处理后11天即转为阴性,并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦,不如用抗生素方便、经济。

      4.其他方法

      除了上述去除污染的方法外,还有动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法等,但均较麻烦,且效果不确定。所以一旦支原体污染,除非有特别重要价值,一般均弃之重新培养。

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