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几种凝胶染色方法介绍

  • 发布日期:2020-12-02      浏览次数:47
    • (一)标准考马斯亮蓝染色法

      (1)电泳后,将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于50%甲醇和10%乙酸中);

      (2)室温下振摇温育4h至过夜;

      (3)去除染色液,收集保存可重复使用20-40次:

      (4)依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室温振摇下脱色。灵敏度为0.1-0.5ug蛋白/每条带。注:使用加热的染色液或脱色液可以缩短染色或脱色时间。将染色液或脱色液在微波炉或水浴中加热,(大约50-60℃),染色时间可缩短至20min,脱色时间约 1-2h。

      (二)快速考马斯亮蓝染色法

      (1)电泳后,将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于50%三氯-乙酸中);

      (2)室温下振摇温育20min;

      (3)去除染色液,收集保存可重复使用多次;

      (4)加入数倍体积的脱色液(25%甲醇、7%乙酸)室温振摇下脱色。必要时可更换脱色液。灵敏度为1.0ug蛋白/每条带。

      (三)凝胶铵银染色法

      (1)电泳后,将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的50%乙醇和10%乙酸,振摇30min至过夜;

      (2)去除50%乙醇和10%乙酸,用去离子水清洗凝胶。加入20%乙醇, 室温振摇30min;

      (3)去除20%乙醇,再加5倍体积的20%乙醇,室温振摇30min;

      (4)去除20%乙醇,将凝胶转入通风柜内,加入5倍体积的用去离子水配制的5%戊二醛,室温振摇30min;

      (5)去除戊二醛,用去离子水清洗凝胶。加入5倍体积的20%乙醇,室温振摇20min;

      (6)去除20%乙醇,重复⑥两次;

      (7)去除20%乙醇,用去离子水清洗凝胶。再加入5倍体积的用去离子水,室温温育10min;

      (8)去除去离子水,加入4倍体积新鲜配制的氨水/银溶液,室温振摇30min。配制100ml:加1.4ml 14.8mol/L氢氧化铵到100ml水中,再加入190ul 10mol/L氢氧化钠;放置涡旋器上缓缓加入1ml新鲜配制的硝酸银溶液(0.8g硝酸银/ml水),直至出现沉淀物,但很快溶解;

      (9)去除氨水/银溶液,用去离子水清洗凝胶20min以上,其间更换水数次;

      (10)去除水,加入5倍体积新鲜配制的0.005%柠檬酸,0.019%的甲醛。轻柔混匀,数分钟内条带即显现出。当背景开始变化时,去除显影剂,用用去离子水清洗凝胶。在10%乙酸和20%乙醇中温育凝胶,以终止反应。灵敏度为1-10ng蛋白/每条带。

      注:操作时,应戴手套并使用洁净的玻璃器皿,以免污染,影响反应的灵敏度。

      (四)凝胶中性银染色法

      (1)电泳后,将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的30%乙醇和10%乙酸,振摇30min至过夜;

      (2)去除乙醇/乙酸溶液,加入5倍体积的30%乙醇, 室温振摇30min;

      (3)去除乙醇,再加5倍体积的30%乙醇,室温振摇30min;

      (4)去除乙醇,加入10倍体积的去离子水,室温振摇10min;重复用去离子水清洗两次;

      (5)去除去离子水,加入4倍体积新鲜配制的0.1%硝酸银溶液(用室温下贮存于棕色瓶内的20%原液稀释而得),室温振摇30min;

      (6)去除硝酸银溶液,用去离子水清洗凝胶20s;

      (7)去除水,加入5倍体积的2.5%碳酸钠和 0.02%的甲醛(pH<4.0),室温振摇温育,数分钟内条带即显现出。当背景开始变黑时,停止温育;

      (8)在1%乙酸内清洗,停止反映。用去离子水清洗,更换数次,每次10min;灵敏度为1-10ng蛋白/每条带。

      (五)凝胶铜染色法凝胶铜染色法为考马斯亮蓝或银染色法的替代染色方法

      将凝胶氯化铜溶液中温育,在Tris和SDS同时存在时可形成明显的白色不透明的沉淀物。蛋白条仍然清晰,留下一个多肽分离模式的附染图象。由于蛋白质未结合在凝胶上,可通过EDTA去除Cu离子而得以洗脱,因而该方法特别适合需快速定位蛋白条带用于免疫反应,或进一步进行蛋白质化学研究。其染色模式如同考马斯亮蓝或银染色法的凝胶,易进行拍照。

      (1)电泳后,凝胶用蒸馏水短时清洗数次,每次30s,勿洗过长时间;

      (2)将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.3mol/L CuCl2;

      (3)室温振摇5min,较厚的凝胶可适当延长时间。当CuCl2 进入凝胶时,在不含蛋白的区域会出现白色沉淀;

      (4)用蒸馏水清洗数分钟,在黑色背景下观察结果。灵敏度为10-100ng蛋白/每条带(0.5mm厚的凝胶)或1ug蛋白/每条带(1mm厚的凝胶)。注:将凝胶在0.25mol/L EDTA、0.25mol/L Tris溶液中温育可使铜染逆转

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