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酶联免疫吸附(ELISA)实验

  • 发布日期:2020-12-08      浏览次数:29
    • 实验方法原理:

      本法首-先也是用特异性抗体包被于固相载体,经洗涤后加入含有抗原之待测样品,如待检样品中有相应抗原存在,即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合,经保温孵育洗涤后,即可加入酶标记特异性抗体,再经孵育洗涤后,加底物显色进行测定,底物降解的量即为欲测抗原的量。

      这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位,因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用,而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此,不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测定。HbSAg及HbS的测定。

      实验材料:血清 血浆 体液

      试剂、试剂盒:碳酸盐包被缓冲液 抗体球蛋白 吐温 柠檬酸 硫酸

      仪器、耗材:酶标比色计 96孔板 移液枪 离心管 离心管盒

      实验步骤:

      一、包被抗体:用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至zui适浓度(1~10 ug /ml),每凹孔加0.3 ml,4℃过夜,或37℃水浴3小时,贮存冰箱。

      二、洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20)洗3次,每次5分钟。

      三、每凹孔加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本,37℃作用1~2小时。

      四、洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20)洗3次,每次5分钟。

      五、加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液,37℃作用1~2小时或由预试实验确定作用时间。

      六、洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20)洗3次,每次5分钟。

      七、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT),室温作用30分钟(另作一空白对照,0.4 ml底物加0.1 ml终止剂)。

      八、加终止剂:每凹孔加2M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml。

      九、观察记录结果:目测或用酶标比色计测定(OPD用492nm)OD值。

      注意事项:

      1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式,这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体,如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙-烯、聚乙-烯及聚氯乙-烯等等。但在ELISA中zui-常用的是聚苯乙-烯或聚氯乙-烯微量反应板及塑料管。

      2.包被所用的抗原必须是可溶性的,而且要求是优质和稳定的制剂,纯度和免疫原性要高。如果不纯,由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置,降低敏感性和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。

      3.对某些抗原必须进行提纯,如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等,它们当中存在着许多非抗原的蛋白质,必须设法除去,常用梯度超速离心或亲和层析法提纯,不经提纯是不能使用的。

      4.用zui适稀释度抗原,包被固相载体不仅经济,而且可以克服前带现象。可通过棋盘滴定法进行测定,但用单项滴定法geng为简便,其方法是将抗原进行一系列稀释包被微量反应板,再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤,再加酶结合物进行反应,经孵育洗涤后,加底物溶液显色,终止反应后分别测定OD值,选择OD值≥1.0的那个抗原稀释度为zui适包被浓度。一般总是要选择那个OD值稍大于1.0,而不选择小于1.0的抗原浓度。阴性参考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求阳性参考血清和阴性参考血清的OD值有明显差别。

      5.抗原包被固相载体除浓度外,对时间、温度、PH均有关系。温度高(如37℃、45℃、或56℃),包被时间可缩短,温度低可延长包被时间。但为了方便起见,通常采用4℃包被过夜,可使抗原吸附得geng加完全且均匀。在用聚苯乙-烯或聚乙-烯微量反应板或塑料管作固相载体时,在碱性条件下(如0.1 mol/L、PH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原)4℃包被过夜较为合适。但在某些试验中,如用LPS或毒素蛋白包被时,用PH 7.2-7.4 PBS稀释才是满意的。包被特异蛋白质的浓度为1-10 ug/ml,而对某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml较为合适,但均应通过滴定。

       

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