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超纯质粒制备操作细则 远慕生物√

  • 发布日期:2021-03-23      浏览次数:77
    • 1溶液配制:

      1.1 Buffer P1:(悬浮用)

        成分:50mM Tris.HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 100ug/mL Rnase A

        配制:

        2M Tris.HCl, pH 8.0  25mL

        0.5M EDTA, pH 8.0  20mL

      双蒸水至 1L,灭菌。

      使用前每1L buffer加入100mg RNAse A,并于4℃保存。

      1.2 Buffer P2:(裂解用)

        成分:200mM NaOH, 1% SDS

        配制:

        8g NaOH固体溶解于500mL双蒸水中,成0.4M NaOH溶液

        10g SDS溶于500mL双蒸水中,成2% SDS溶液

        使用前将上述两种溶液等体积混合后使用

        注意:

          Buffer P2混合后不宜放置时间过场,每次配够一周使用的即可。长时间放置容易产生沉淀。若有沉淀产生,在37℃保温一段时间使沉淀溶解。

      1.3 Buffer P3:(中和用)

        成分:3M KAc(醋酸钾),pH4.8

        配制:将147g KAc 溶于350mL双蒸水中,用约60mL冰醋酸调节PH值,然后继续用浓盐酸调节pH值至约5左右.蕞后定容至500mL。

      1.4 Buffer QBT:(平衡用)

      成分:750mL NaCl; 50mM MOPS.Ph7.0;15% 异丙醇,0.15% Triton X-100

      配制:溶解43.83g NaCl, 10.46g MOPS到800 mL 双蒸水中,调节pH值至7.0,然后加入150mL 异丙醇和15Ml Triton X-100,加水定容至1L。

      1.5 Buffer QC:(洗涤用)

      成分:1.0 M NaCl,50Mm MOPS, Ph7.0

      配制:溶解58.44g NaCl, 10.46 MOPS至800 mL 双蒸水中,调节pH值至7.0,然后加入150mL异丙醇,定容至1L。

      2 Qiagen-tip 20质粒小量提取操作步骤

      2.1 取过夜培养的菌液2mL,12000rpm离心30秒至1分钟,去净上清。

      2.2用0.3mL Buffer P1重新充分悬浮沉淀。

      2.3加入0.3mL Buffer P2,轻轻颠倒摇匀,室温下放置5分钟。

      注意:此步不应剧烈振荡,否则容易在所提质粒中混入基因组DNA。

      2.4 Buffer P2使用后应盖紧盖子,否则NaOH易与空气中的CO2起反应。

      2.5 加入0.3mL Buffer P3,轻轻混匀,于4℃冰箱中放置10分钟。

      12000rpm高速离心15分钟。

      2.6 用1mL Buffer QBT平衡Qiagen-tip 20柱,并让QBT慢慢流下。

      2.7 将步骤5所得的上清倒入已平衡好的Qiagen-tip 20柱,让其慢慢流下。

      2.8 每次用1mL QC清洗Qiagen-tip 20柱,清洗3次。

      2.9用0.8mL QF洗脱DNA。

      2.10 用0.6倍体积(500uL)的异丙醇沉淀质粒,颠倒混匀,室温放置5分钟,12000rpm高速离心15分钟。

      2.11去上清,用1mL 70%乙醇洗涤沉淀,12000rpm高速离心3分钟,去净上清。

      2.12重复步骤11一次。

      注意:洗涤时,每次用吸水纸吸一下,尽量去净残余的液体。

      去净上清很重要,否则除不净多余的盐分,将严重影响的后面的测序反应。

      2.13 抽干多余的乙醇,用30~50uL双蒸水溶解DNA,取2uL电泳检测定量,用于测序。

      3 Qiagen-tip 20柱子的清洗处理

      3.1用5mL缓冲液清洗柱子,洗去多余的DNA及其他杂质,备用。

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