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菌落PCR(Colony PCR)实验方法

  • 发布日期:2021-04-22      浏览次数:22
    • 菌落PCR(Colony PCR)可不必提取基因组DNA,不必酶切鉴定,而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增,省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。蕞后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。

      具体方法:

      1、PCR混合物的制备

      Taq buffer(10×) 20 ul

      dNTP(2.5 mM) 5 ul

      Primer Forward(50 mM) 10 ul

      Primer Reverse(50 mM) 10 ul

      ddH 2O 147 ul

      Taq(2U/ul) 8 ul

      total 200 ul

      将上述溶液混匀,10 ul每管分装于200 ul PCR管中。

      2、常温下随机挑选转化板上的转化子,用灭菌的牙签或抢头挑取少量菌体,在LB琼脂糖平板上轻点,做一拷贝;然后将沾有菌体的牙签或抢头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下(管子做好记号,如平板上点的是1#,则管子上也标1#,以便筛选到克隆后的扩到培养),盖紧管子。

      3、将混有菌体的PCR混合物置于 PCR仪 中,按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。

      4、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜,使菌落扩增;次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板,直接接种摇菌,如果早上做PCR的话,下午就可以提质粒,得到重组载体。

      注意事项:设计引物很关键。一般如果是定向克隆,用载体上的通用引物即可;如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆(如单酶切或平末端连接),一条引物用载体,一条引物用目的基因上的,这样就可以比较方便的鉴定了,而且错误概率很低。PCR条件的选择接近蕞佳,同时挑取的菌体不宜太多,否则会有非特异性扩增。

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