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免疫荧光技术你真的会吗?

  • 发布日期:2021-04-27      浏览次数:12
    • 一、直接免疫荧光法
      (一)基本原理
      将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。

      (二)试剂与仪器
      磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
      荧光标记的抗体溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS进行稀释
      缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制
      搪瓷桶三只(内有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)
      有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)
      荧光显微镜
      玻片架
      滤纸
      37℃温箱等。

      (三)实验步骤
      1. 滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持一定湿度。
      2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温一定时间(参考:30min)。
      3. 取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS冲洗后,再按顺序过0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不时振荡。
      4. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。
      5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:
      (-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光明亮;(+++ --++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)或(-),即可判定为阳性。

      (四)注意事项
      1. 对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。
      2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从10 min到数小时,一般30 min已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于37℃可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2℃的低温,延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效-果好的多。
      3. 为了保证荧光染色的正确性,shou次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
      (1) 标本自发荧光对照:标本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。
      (2) 特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体。
      (3) 阳性对照:已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
      如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。
      4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本蕞好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。


      二、间接免疫荧光法测抗体
      (一)基本原理
      染色程序分为两步,第1步,用未知未标记的抗体(待检标本)加到已知抗原标本上,在湿盒中37℃保温30min,使抗原抗体充分结合,然后洗涤,除去未结合的抗体。第二步,加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第1步发生了抗原抗体反应,标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合,从而可鉴定未知抗体。


      (二)试剂与仪器
      磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
      缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
      荧光标记的抗人球蛋白抗体:以0.01mol/L,pH7.4的PBS进行稀释 。
      搪瓷桶三只(内有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)
      有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)
      荧光显微镜
      玻片架
      滤纸
      37℃温箱等。


      (三)实验步骤
      1. 滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于已知抗原标本片,10min后弃去,使标本片保持一定湿度。
      2. 滴加以0.01mol/L,pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本,覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内,37℃保温30min。
      3. 取出玻片,置于玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS冲洗1-2次,然后按顺序过0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸5min,不时振荡 。
      4. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。
      5. 将玻片平放在有盖搪瓷盒内,37℃保温30min。
      6. 重复操作3。
      7. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,滴加一滴缓冲甘油,再覆以盖玻片。
      8. 荧光显微镜高倍视野下观察,结果判定同直接法。

      (四)注意事项
      1. 荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,时间过长 ,会使荧光减弱。
      2. 每次试验时 ,需设置以下三种对照:
      (1) 阳性对照:阳性血清+荧光标记物
      (2) 阴性对照:阴性血清+荧光标记物
      (3) 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物
      3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中,始终保持湿润,避免干燥。
      4. 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物,应始终保持在已知抗原标本片上,避免因放置不平使液体流失,从而造成非特异性荧光染色。

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